Invitrogen核/膜系統(tǒng)
一、 實驗原理：
真核生物基因的轉(zhuǎn)錄起始需轉(zhuǎn)錄因子參與，轉(zhuǎn)錄因子通常由DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域(DNA—bindingdomain，BD)和轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域(activationdomain，AD)。用于酵母單雜交系統(tǒng)的酵母GAL4蛋白是一種典型的轉(zhuǎn)錄因子，GAL4的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域靠近羧基端，含有幾個鋅指結(jié)構(gòu)，可激活酵母半乳糖苷酶的上游激活位點(UAS)，而轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域可與RNA聚合酶或轉(zhuǎn)錄因子TFIID相互作用，提高RNA聚合酶的活性。在這一過程中，DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域和轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域可完全獨立地發(fā)揮作用。在GAL4系統(tǒng)中構(gòu)建與基因的ORFs融合的激活結(jié)構(gòu)域GAL4-AD的特異載體，順式作用元件與GAL4的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域GAL4-BD融合構(gòu)建載體，分別轉(zhuǎn)化酵母細胞。在酵母內(nèi)表達的蛋白若與順式作用元件發(fā)生相互作用時，就會將GAL4-BD和GAL4-AD結(jié)合在一起，從而與上游激活序列(upstreamactivatingsequence，UAS)結(jié)合，激活相應(yīng)報告基因的表達，在相應(yīng)的營養(yǎng)缺陷型培養(yǎng)基上篩選陽性?；蜣D(zhuǎn)錄實際上是轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子和啟動子區(qū)各種順式作用元件相互作用的結(jié)果，這種結(jié)合猶如蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)的互作一樣具有特異性，這是研究順式作用元件即DNA序列與蛋白質(zhì)互作的基礎(chǔ)。

二、實驗步驟：
1.1  RNA提取

1.2  mRNA分離

1.3  cDNA初級文庫的構(gòu)建
1.3.1cDNA第一鏈的合成
1.3.2cDNA第二鏈的合成
1.3.3cDNAadapter的制備
1.3.4cDNA與attB1重組接頭連接(三份接頭各連一份)
1.3.5cDNA分級分離
1.3.6BP重組
1.3.7電轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH10B
1.3.8文庫克隆檢測
1.3.9文庫庫容量、重組率、插入片段長度鑒定

1.4  cDNA次級文庫的構(gòu)建
1.4.1初級文庫的質(zhì)粒抽提
1.4.2LR重組
1.4.3電轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH10B
1.4.4文庫克隆檢測
1.4.5文庫庫容量、重組率、插入片段長度鑒定

三、實驗結(jié)果：
次級文庫庫容大于107，重組率大于90%，平均插入片段大于1kb。Invitrogen核/膜系統(tǒng)
一、 實驗原理：
真核生物基因的轉(zhuǎn)錄起始需轉(zhuǎn)錄因子參與，轉(zhuǎn)錄因子通常由DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域(DNA—bindingdomain，BD)和轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域(activationdomain，AD)。用于酵母單雜交系統(tǒng)的酵母GAL4蛋白是一種典型的轉(zhuǎn)錄因亠子，GAL4的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域靠近羧基端，含有幾個鋅指結(jié)構(gòu)，可激活酵母半乳糖苷酶的上游激活位點(UAS饣)，而轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域可與RNA聚合酶或轉(zhuǎn)錄因子TFIID相互作用，提高RNA聚合酶的活性。在這一過程中，DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域和轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域可完全獨立地發(fā)揮作用。在GAL4系統(tǒng)中構(gòu)建與基因的ORFs融合的激活結(jié)構(gòu)域GAL4-AD的特異載體，順式作用元件與GAL4的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域GAL4-BD融合構(gòu)建載體，分別轉(zhuǎn)化酵母細胞。在酵母內(nèi)表達的蛋白若與順式作用元件發(fā)生相互作用時，.淳風(fēng)生物科技___r石家莊酵母單雜交文庫實驗
，就會將GAL4-BD和GAL4-AD結(jié)合在一起，從而與上游激活序列(upstreamactivatingsequence，UAS)結(jié)合，激活相應(yīng)報告基因的表達，在相應(yīng)的營養(yǎng)缺陷型培養(yǎng)基上篩選陽性?；蜣D(zhuǎn)錄實際上是轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子和啟動子區(qū)各種順式作用元件相互作用的結(jié)果，這種結(jié)合猶如蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)的互作一樣具有特異性，這是研究順式作用元件即DNA序列與蛋白質(zhì)互作的基礎(chǔ)。

二、實驗步驟：
1.1  RNA提取

1.2  mRNA分離

1.3  cDNA初級文庫的構(gòu)建
1.3.1cDNA第一鏈的合成
1.3.2cDNA第二鏈的合成
1.3.3cDNAadapter的制備
1.3.4cDNA與attB1重組接頭連接(三份接頭各連一份)
1.3.5cDNA分級分離
1.3.6BP重組
1.3.7電轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH10B
1.3.8文庫克隆檢測
1.3.9文庫庫容量、重組率、插入片段長度鑒定

1.4  cDNA次級文庫的構(gòu)建
1.4.1初級文庫的質(zhì)粒抽提
1.4.2LR重組
1.4.3電轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH10B
1.4.4文庫克隆檢測
1.4.5文庫庫容量、重組率、插入片段長度鑒定

三、實驗結(jié)果：
次級文庫庫容大于107，重組率大于90%，平均插入片段大于1kb。Invitrogen核/膜系統(tǒng)
一、 實驗原理：
真核生物基因的轉(zhuǎn)錄起始需轉(zhuǎn)錄因子參與，轉(zhuǎn)錄因子通常由DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域(DNA—bindingdomain，BD)和轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域(activationdomain，AD)。用于酵母單雜交系統(tǒng)的酵母GAL4蛋白是一種典型的轉(zhuǎn)錄因子，西安淳風(fēng)生物科技有限公司，淳風(fēng)生物科技，GAL4的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域靠近羧基端，含有幾個鋅指結(jié)構(gòu)，可激活酵母半乳糖苷酶的上游激活位點(UAS)，而轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域可與RNA聚合酶或轉(zhuǎn)錄因子TFIID相互作用，提高RNA聚合酶的活性。在這一過程中，DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域和轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域可完全獨立地發(fā)揮作用。在GAL4系統(tǒng)中構(gòu)建與基因的ORFs融合的激活結(jié)構(gòu)域GAL4-AD的特異載體，順式作用元件與GAL4的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域GAL4-BD融合構(gòu)建載體，.淳風(fēng)生物科技___r石家莊酵母單雜交文庫實驗
，分別轉(zhuǎn)化酵母細胞。在酵母內(nèi)表達的蛋白若與順式作用元件發(fā)生相互作用時，就會將GAL4-BD和GAL4-AD結(jié)合在一起，從而與上游激活序列(upstreamactivatingsequence，UAS)結(jié)合，激活相應(yīng)報告基因的表達，在相應(yīng)的營養(yǎng)缺陷型培養(yǎng)基上篩選陽性?；蜣D(zhuǎn)錄實際上是轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子和啟動子區(qū)各種順式作用元件相互作用的結(jié)果，這種結(jié)合猶如蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)的互作一樣具有特異性，這是研究順式作用元件即DNA序列與蛋白質(zhì)互作的基礎(chǔ)。

二、實驗步驟：
1.1  RNA提取

1.2  mRNA分離

1.3  cDNA初級文庫的構(gòu)建
1.3.1cDNA第一鏈的合成
1.3.2cDNA第二鏈的合成
1.3.3cDNAadapter的制備
1.3.4cDNA與attB1重組接頭連接(三份接頭各連一份)
1.3.5cDNA分級分離
1.3.6BP重組
1.3.7電轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH10B
1.3.8文庫克隆檢測
1.3.9文庫庫容量、重組率、插入片段長度鑒定

1.4  cDNA次級文庫的構(gòu)建
1.4.1初級文庫的質(zhì)粒抽提
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