Invitrogen核/膜系統(tǒng)一、實驗原理：真核生物基因的轉錄起始需轉錄因子參與，轉錄因子通常由DNA結合結構域(DNA—bindingdomain，BD)和轉錄激活結構域(activationdomain，.淳風生物科技|||貴陽酵母單雜交文庫，AD)。用于酵母單雜交系統(tǒng)的酵母GAL4蛋白是一種典型的轉錄因子，GAL4的DNA結合結構域靠近羧基端，含有幾個鋅指結構，可激活酵母半乳糖苷酶的上游激活位點(UAS)，而轉錄激活結構域可與RNA聚合酶或轉錄因子TFIID相互作用，提高RNA聚合酶的活性。在這一過程中，DNA結合結構域和轉錄激活結構域可完全獨立地發(fā)揮作用。在GAL4系統(tǒng)中構建與基因的ORFs融合的激活結構域GAL4-AD的特異載體，順式作用元件與GAL4的DNA結合結構域GAL4-BD融合構建載體，分別轉化酵母細胞。在酵母內(nèi)表達的蛋白若與順式作用元件發(fā)生相互作用時，就會將GAL4-BD和GAL4-AD結合在一起，從而與上游激活序列(upstreamactivatingsequence，UAS)結合，激活相應報告基因的表達，在相應的營養(yǎng)缺陷型培養(yǎng)基上篩選陽性?；蜣D錄實際上是轉錄調控因子和啟動子區(qū)各種順式作用元件相互作用的結果，這種結合猶如蛋白質與蛋白質的互作一樣具有特異性，這是研究順式作用元件即DNA序列與蛋白質互作的基礎。二、實驗步驟：1.1RNA提取1.2mRNA分離1.3cDNA初級文庫的構建1.3.1cDNA第一鏈的合成1.3.2cDNA第二鏈的合成1.3.3cDNAadapter的制備1.3.4cDNA與attB1重組接頭連接(三份接頭各連一份)1.3.5cDNA分級分離1.3.6BP重組1.3.7電轉化大腸桿菌DH10B1.3.8文庫克隆檢測1.3.9文庫庫容量、重組率、插入片段長度鑒定1.4cDNA次級文庫的構建1.4.1初級文庫的質粒抽提1.4.2LR重組1.4.3電轉化大腸桿菌DH10B1.4.4文庫克隆檢測1.4.5文庫庫容量、重組率、插入片段長度鑒定三、實驗結果：次級文庫庫容大于107，重組率大于90%，平均插入片段大于1kb。Invitrogen核/膜系統(tǒng)一、實驗原理：真核生物基因的轉錄起始需轉錄因子參與，轉錄因子通常由DNA結合結構域(DNA—bindingdomain，BD)和轉錄激活結構域(activationdomain，AD)。用于酵母單雜交系統(tǒng)的酵母GAL4蛋白是一種典型的轉錄因子，GAL4的DNA結合結構域靠近羧基端，含有幾個鋅指結構，可激活酵母半乳糖苷酶的上游激活位點(UAS)，而轉錄激活結構域可與RNA聚合酶或轉錄因子TFIID相互作用，提高RNA聚合酶的活性。在這一過程中，DNA結合結構域和轉錄激活結構域可完全獨立地發(fā)揮作用。在GAL4系統(tǒng)中構建與基因的ORFs融合的激活結構域GAL4-AD的特異載體，順式作用元件與GAL4的DNA結合結構域GAL4-BD融合構建載體，分別轉化酵母細胞。在酵母內(nèi)表達的蛋白若與順式作用元件發(fā)生相互作用時，就會將GAL4-BD和GAL4-AD結合在一起，從而與上游激活序列(upstreamactivatingsequence，UAS)結合，激活相應報告基因的表達，在相應的營養(yǎng)缺陷型培養(yǎng)基上篩選陽性。基因轉錄實際上是轉錄調控因子和啟動子區(qū)各種順式作用元件相互作用的結果，西安淳風生物科技有限公司，淳風生物科技，這種結合猶如蛋白質與蛋白質的互作一樣具有特異性，這是研究順式作用元件即DNA序列與蛋白質互作的基礎。二、實驗步驟：1.1RNA提取1.2mRNA分離1.3cDNA初級文庫的構建1.3.1cDNA第一鏈的合成1.3.2cDNA第二鏈的合成1.3.3cDNAadapter的制備1.3.4cDNA與attB1重組接頭連接(三份接頭各連一份)1.3.5cDNA分級分離1.3.6BP重組1.3.7電轉化大腸桿菌DH10B1.3.8文庫克隆檢測1.3.9文庫庫容量、重組率、插入片段長度鑒定1.4cDNA次級文庫的構建1.4.1初級文庫的質粒抽提1.4.2LR重組1.4.3電轉化大腸桿菌DH10B1.4.4文庫克隆檢測1.4.5文庫庫容量、重組率、插入片段長度鑒定三、實驗結果：次級文庫庫容大于10饣7，重組率大于90%，平均插入片段大于1kb。Invitrogen核/膜系統(tǒng)一、實驗原理：真核生物基因的轉錄起始需轉錄因子參與，轉錄因子通常由DNA結合結構域(DNA—bindingdomain，.淳風生物科技|||貴陽酵母單雜交文庫，BD)和轉錄激活結構域(activationdomain，AD)。用于酵母單雜交系統(tǒng)的酵母GAL4蛋白是一種典型的轉錄因子，GAL4的DNA結合結構域靠近羧基端，含有幾個鋅指結構，可激活酵母半乳糖苷酶的上游激活位點(UAS)，而轉錄激活結構域可與RNA聚合酶或轉錄因子TFIID相互作用，提高RNA聚合酶的活性。在這一過程中，DNA結合結構域和轉錄激活結構域可完全獨立地發(fā)揮作用。在GAL4系統(tǒng)中構建與基因的ORFs融合的激活結構域GAL4-AD的特異載體，順式作用元件與GAL4的DNA結合結構域GAL4-BD融合構建載體，分別轉化酵母細胞。在酵母內(nèi)表達的蛋白若與順式作用元件發(fā)生相互作用時，就會將GAL4-BD和GAL4-AD結合在彐一起，從而與上游激活序列(upstreamactivatingsequence，UAS)結合，激活相應報告基因的表達，在相應的營養(yǎng)缺陷型培養(yǎng)基上篩選陽性?；蜣D錄實際上是轉錄調控因子和啟動子區(qū)各種順式作用元件相互作用的結果，這種結合猶如蛋白質與蛋白質的互作一樣具有特異性，這是研究順式作用元件即DNA序列與蛋白質互作的基礎。二、實驗步驟：1.1RNA提取1.2mRNA分離1.3cDNA初級文庫的構建1.3.1cDNA第一鏈的合成1.3.2cDNA第二鏈的合成1.3.3cDNAadapter的制備1.3.4cDNA與attB1重組接頭連接(三份接頭各連一份)1.3.5cDNA分級分離1.3.6BP重組1.3.7電轉化大腸桿菌DH10B1.3.8文庫克隆檢測1.3.9文庫庫容量、重組率、插入片段長度鑒定1.4cDNA次級文庫的構建1.4.1初級文庫的質粒抽提1.4.2.淳風生物科技|||貴陽酵母單雜交文庫