Invitrogen核/膜系統(tǒng)一、實驗原理：酵母雙雜交系統(tǒng)是在酵母體內(nèi)通過重建有活性轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)構(gòu)來鑒定蛋白質(zhì)之間的相互作用。轉(zhuǎn)錄因子可以和DNA上特異的序列結(jié)合而啟動相應(yīng)基因的轉(zhuǎn)錄。這種DNA結(jié)合與轉(zhuǎn)錄激活的功能是由轉(zhuǎn)錄因子上兩個相互獨立的結(jié)構(gòu)域即DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域(BindingDomain，BD)和轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域(ActivationDomain，AD)分別來完成的，并且這兩個結(jié)構(gòu)域?qū)τ诨虻霓D(zhuǎn)錄激活都是必須的。在GAL4系統(tǒng)中利用轉(zhuǎn)錄因子GAL4的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域GAL4-BD與激活結(jié)構(gòu)域GAL4-AD的特異載體，分別與基因的ORFs融合，轉(zhuǎn)化酵母細胞。在酵母內(nèi)表達的蛋白若發(fā)生相互作用時，就會將GAL4-BD和GAL4-AD結(jié)合在一起，從而與上游激活序列(upstreamactivatingsequence，UAS)結(jié)合，激活相應(yīng)報告基因的表達，在相應(yīng)的營養(yǎng)缺陷型培養(yǎng)基上篩選陽性。酵母雙雜交文庫的構(gòu)建是篩庫的前提，西安淳風生物科技有限公司，淳風生物科技，可用于目的蛋白的互作蛋白大規(guī)模篩選分析蛋白質(zhì)間的相互作用，是現(xiàn)在分子生物學(xué)與生物化學(xué)常用的手段。二、實驗步驟：1.1RNA提取1.2mRNA分離1.3cDNA初級文庫的構(gòu)建1.3.1cDNA第一鏈的合成1.3.2cDNA第二鏈的合成1.3.3cDNAadapter的制備1.3.4cDNA與attB1重組接頭連接(三份接頭各連一份)1.3.5cDNA分級分離1.3.6BP重組1.3.7電轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH10B1.3.8文庫克隆檢測1.3.9文庫庫容量、重組率、插入片段長度鑒定1.4cDNA次級文庫的構(gòu)建1.4.1初級文庫的質(zhì)粒抽提1.4.2LR重組1.4.3電轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH10B1.4.4文庫克隆檢測1.4.5文庫庫容量、重組率、插入片段長度鑒定三、實驗結(jié)果：次級文庫庫容大于107，重組率大于90%，平均插入片段大于1kb。Invitrogen核/膜系統(tǒng)一、實驗原理：酵母雙雜交系統(tǒng)是在酵母體內(nèi)通過重建有活性轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)構(gòu)來鑒定蛋白質(zhì)之間的相互作用。轉(zhuǎn)錄因子可以和DNA上特異的序列結(jié)合而啟動相應(yīng)基因的轉(zhuǎn)錄。這種DNA結(jié)合與轉(zhuǎn)錄激活的功能是由轉(zhuǎn)錄因子上兩個相互獨立的結(jié)構(gòu)域即DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域(BindingDomain，BD)和轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域(ActivationDomain，AD)分別來完成的，成都酵母雙雜交文庫構(gòu)建，并且這兩個結(jié)構(gòu)域?qū)τ诨虻霓D(zhuǎn)錄激活都是必須的。在GAL4系統(tǒng)中利用轉(zhuǎn)錄因子GAL4的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域GAL4-BD與激活結(jié)構(gòu)域GAL4-AD的特異載體，分別與基因的ORFs融合，轉(zhuǎn)化酵母細胞。在酵母內(nèi)表達的蛋白若發(fā)生相互作用時，就會將GAL4-BD和GAL4-AD結(jié)合在一起，從而與上游激活序列(upstreamactivatingsequence，UAS)結(jié)扌合，激活相應(yīng)報告基因的表達，在相應(yīng)的營養(yǎng)缺陷型培養(yǎng)基上篩選陽性。酵母雙雜交文庫的構(gòu)建是篩庫的前提，可用于目的蛋白的互作蛋白大規(guī)模篩選分析蛋白質(zhì)間的相互作用，是現(xiàn)在分子生物學(xué)與生物化學(xué)常用的手段。二、實驗步驟：1.1RNA提取1.2mRNA分離1.3cDNA初級文庫的構(gòu)建1.3.1cDNA第一鏈的合成1.3.2cDNA第二鏈的合成1.3.3cDNAadapter的制備1.3.4cDNA與attB1重組接頭連接(三份接頭各連一份)1.3.5cDNA分級分離1.3.6BP重組1.3.7電轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH10B1.3.8文庫克隆檢測1.3.9文庫庫容量、重組率、插入片段長度鑒定1.4cDNA次級文庫的構(gòu)建1.4.1初級文庫的質(zhì)粒抽提1.4.2LR重組1.4.3電轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH10B1.4.4文庫克隆檢測1.4.5文庫庫容量、重組率、插入片段長度鑒定三、實驗結(jié)果：次級文庫庫容大于10氵7，重組率大于90%，平均插入片段大于1kb。Invitrogen核/膜系統(tǒng)一、實驗原理：酵母雙雜交系統(tǒng)是在酵母體內(nèi)通過重建有活性轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)構(gòu)來鑒定蛋白質(zhì)之間的相互作用。轉(zhuǎn)錄因子可以和DNA上特異的序列結(jié)合而啟動相應(yīng)基因的轉(zhuǎn)錄。這種DNA結(jié)合與轉(zhuǎn)錄激活的功能是由轉(zhuǎn)錄因子上兩個相互獨立的結(jié)構(gòu)域即DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域(BindingDomain，BD)和轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域(ActivationDomain，AD)分別來完成的，并且這兩個結(jié)構(gòu)域?qū)τ诨虻霓D(zhuǎn)錄激活都是必須的。在GAL4系統(tǒng)中利用轉(zhuǎn)錄因子GAL4的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域GAL4-BD與激活結(jié)構(gòu)域GAL4-AD的特異載體，分別與基因的ORFs融合，轉(zhuǎn)化酵母細胞。在酵母內(nèi)表達的蛋白若發(fā)生相互作用時，就會將GAL4-BD和GAL4-AD結(jié)合在一起，從而與上游激活序列(upstreamactivatingsequence，UAS)結(jié)合，激活相應(yīng)報告基因的表達，在相應(yīng)的營養(yǎng)缺陷型培養(yǎng)基上篩選陽性。酵母雙雜交文庫的構(gòu)建是篩庫的前提，可用于目的蛋白的互作蛋白大規(guī)模篩選分析蛋白質(zhì)間的相互作用，成都酵母雙雜交文庫構(gòu)建，是現(xiàn)在分子生物學(xué)與生物化學(xué)常用的手段。二、實驗步驟：1.1RNA提取1.2mRNA分離1.3cDNA初級文庫的構(gòu)建1.3.1cDNA第一鏈的合成1.3.2cDNA第二鏈的合成1.3.3cDNAadapter的制備1.3.4cDNA與attB1重組接頭連接(三份接頭各連一份)1.3.5cDNA分級分離1.3.6BP重組1.3.7電轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH10B1.3.8文庫克隆檢測1.3.9文庫庫容量、重組率、插入片段長度鑒定1.4cDNA次級文庫的構(gòu)建1.4.1初級文庫的質(zhì)粒抽提1.4.2LR重組1.4.3電轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH10B1.4.4文庫克隆檢測1.4.5文庫庫容量、重組率、插入片段長度鑒定三、實驗結(jié)果：次級文庫庫容大于107，重組率大于90%，平均插入片段大于1kb。.淳風生物科技///成都酵母雙雜交文庫構(gòu)建